蒸汽灭菌是将产品放置于灭菌柜内，高温蒸汽迅速释放的热量而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。纯蒸汽灭菌的特点是穿透性强，蛋白质、原生质胶体在湿热条件下用以变性凝固，酶系统容易破坏，蒸汽进入细胞内凝结成水，能够放出潜在热量提高温度，更增强了杀菌力。

密闭的灭菌柜内利用抽气设备抽出空气等不凝性气体。因为空气等不凝性气体的存在不仅阻碍热量的传递，也阻碍了蒸汽对产品的渗透。

蒸汽灭菌温度是灭菌柜首要控制的蒸汽参数。各种病菌和微生物对热的耐受力因种类而不同，因此根据灭菌物品污染程度，其所需的灭菌温度和作用时间也各不相同。产品的灭菌温度也同时决定于产品本身的耐热程度和高温对产品某些特性的损害影响。

一般而言为了保证加热效率和缩短灭菌间隔，灭菌温度愈高，所需灭菌时间愈短。蒸汽温度的检测往往有一定的不均匀性，同时温度的检测也有一定的滞后性和偏差，考虑到饱和蒸汽的温度和压力呈现一一对应的关系，相对而言蒸汽压力检测更加均匀和快速检测，因而灭菌柜的灭菌蒸汽压力作为控制基础，而灭菌温度的检测作为安全保证。

实际应用中，蒸汽的温度和灭菌温度有时会不同。一方面当蒸汽中含有3%以上的冷凝水（干度为97%）时，虽然蒸汽的温度达标，但由于分布在产品表面的冷凝水对热量传递的阻碍，蒸汽温度经过冷凝水膜时会逐步递减，使得到达产品的实际灭菌温度会低于灭菌温度要求。特别是锅炉携带的炉水，其水质可能会污染灭菌产品。所以通常在蒸汽入口采用瓦特DF200高效汽水分离器会非常有效。

另外一方面，空气的存在会对蒸汽的灭菌温度形成另外的影响，当柜室内的空气未排除或未完全排除，一方面空气的存在会形成冷点，使得附着空气的产品达不到灭菌温度。另外一方面，通过控制蒸汽压力来控制温度的控制方式，空气的存在产生部分分压，此时压力表显示的压力是混合气体的总压，实际的蒸汽压力低于灭菌蒸汽压力要求，因此蒸汽温度也无法达到灭菌温度要求，从而导致灭菌失败。

蒸汽过热度是影响蒸汽灭菌的一个重要因素，经常会被忽略，EN285要求灭菌蒸汽过热度不应超过5℃。饱和蒸汽灭菌原理是蒸汽遇冷产品凝结而释放出大量的潜热能，使产品的温度上升；而冷凝的同时，其体积急剧收缩(1/1600)，还可产生局部负压，使随后的蒸汽穿透到物品的深。

过热蒸汽，其性质相当于干燥的空气，其本身的传热效率低下；另外一方面，过热蒸汽释放显热而温度下降没有达到饱和点时，不会发生冷凝，此时放出的热量非常小，使得热量传输达不到灭菌要求。此现象在过热5℃以上时即表现明显。蒸汽过热还可导致物品快速老化。

如果使用的蒸汽是发电用的热网蒸汽，其本身就是过热蒸汽。许多时候即使自备锅炉产生的是饱和蒸汽，但在灭菌柜前的蒸汽减压是一种绝热膨胀，使得原本的饱和蒸汽变成过热蒸汽。当压差超过3bar时，这个影响就很明显了。如果过热度超过5℃，优先选用瓦特水浴式饱和蒸汽装置及时消除过热度。

灭菌柜的蒸汽设计包含蒸汽入口配置超级蒸汽过滤器、高效汽水分离器、蒸汽压力调节阀和疏水器等。